PERSONALIZED CANCER VACCINE · DECISION GUIDE

从肿瘤样本，走到一条可验证的 mRNA 新抗原疫苗

这不是一张“万能参数表”，而是一套可审计的决策系统：每个候选为何进入、为何淘汰、哪项证据仍然缺失，都能被追溯。

先看结论 →生成测序起点

肿瘤 × 正常 × RNAHLA-I + HLA-II预测 ≠ 免疫原性

样本与测序

用配对肿瘤–正常证据区分体细胞与种系事件

HLA 与逃逸

分别评估 HLA-I 肿瘤逃逸与 HLA-II 的 APC 呈递路径

筛选与组合

从预测分数走向可解释的候选组合

序列工程

控制连接区、翻译、纯度与递送

实验闭环

证明表达、天然呈递和 T 细胞杀伤

THE SHORT ANSWER

如果现在就要形成一个可验证的起点

适用于尚未锁定平台、以编码新抗原为主的个体化肿瘤疫苗研发。以下数字是预算与 assay 验证网格，不是跨癌种、跨平台的临床标准。

DNA

编码 SNV/indel 主线先评估 WES；发现型问题再用 WGS

若必须先做预算，新鲜且 purity ≥50% 可用肿瘤 WES 150–200×、正常 80–100×作为情景网格；purity 20–50% 或 FFPE 可预留 250–300× / 120–150×，但必须以文库复杂度和 LoD 验证收敛。需要 SV、非编码或非经典 ORF 时，WGS 可从 ICGC 的肿瘤 60× / 正常 30×研究级起点出发，按低纯度和目标 VAF 加深。^1·2·26

RNA

RNA-seq 是证据主干，但没有统一 reads/读长标准

它用于确认 mutant allele expression、转录本、融合、异常剪接与 HLA allele expression。预算可先按50–100M paired-end fragments设网格，降解、融合或低表达目标再做饱和度模拟；合同必须写清按 reads 还是 read pairs 计数。PE150 不是 mRNA 平台的必要条件。^2·3·12

HLA

专门分型，值得单独设计

用正常血 DNA做 A/B/C 与 DR/DQ/DP 高分辨率分型；WES/WGS/RNA 推断只作交叉核对。采购时写入全/近全基因相位、等位平衡、歧义处理和重复规则，而不只写“测多少×”。^3·4·6

BUILD

12–20 个、25–31 aa 是开发网格，不是统一标准

不要把 8–11 aa 最小表位直接硬拼。公开先例中，autogene cevumeran 的 SNV 窗口为 27 aa，最多 20 个候选分到两条 RNA、每条不超过 10 个，并使用 10 aa G/S-rich linker；V940 可编码最多 34 个。^12·14

一句话判断

以编码 SNV/indel 为主时，配对 WES + 肿瘤 RNA-seq + 正常血专门 HLA是常见且务实的基础组合；发现 SV、非编码或非经典 ORF 时改为配对 WGS + RNA-seq + 专门 HLA。成本效益取决于样本、平台和周转目标；深度按可用独立 reads 与经验证 LoD 结算。

DEPTH WORKBENCH

把样本条件带进预算与验证网格

一个有用的近似：二倍体、杂合、克隆性突变的期望 VAF 约为 purity ÷ 2；期望突变 reads ≈ 有效深度 × VAF。30% purity 的 150× WES，理想情况下约有 22 个突变 reads，但 CNV、亚克隆、重复和捕获偏差都会进一步降低；因此必须以真实材料验证 LoD。

样本状态

估计肿瘤纯度

项目目标

当前预算 / 验证网格

预算网格：WES 200–250× 肿瘤 / 100–120× 正常

蛋白编码突变是当前个体化疫苗最成熟的来源，深 WES 在成本、周转和低 VAF 灵敏度间更均衡。

RNA预算网格：RNA-seq 80–100M；读长按平台验证

HLA正常血专门高分辨率分型；HLA-I 肿瘤逃逸与 HLA-II APC 路径分开解释

这些数值只用于项目预算和验证设计，不是跨平台放行标准。最终深度与读长必须由 purity、拷贝数、目标 VAF、文库复杂度、重复率、位点可比对性和经验证 LoD 共同反推。

01 · SEQUENCING

WES、WGS、RNA 和 HLA 各自回答不同问题

“测得更深”不能修复坏样本。先做病理复核、肿瘤纯度/坏死评估、显微切割、DNA/RNA 质量与样本身份核对，再决定深度。

数据层	证据锚点 / 预算网格	它最擅长回答	何时升级 / 降级	关键 QC
配对 WES	无跨平台统一值；预算网格可设 purity ≥50%：150–200× / 80–100×；purity 20–50%：250–300× / 120–150×	编码 SNV/indel、部分 CNV；成熟、快、单位成本深	先按目标 VAF、捕获均一性和可用独立 reads 模拟；FFPE 或更低 purity 先改善样本再谈加深^2·26	on-target、30×覆盖比例、duplicate、FFPE C>T、cross-contamination
配对 WGS	ICGC 研究级起点：肿瘤 60× / 正常 30×；复杂/低纯度项目预算可上调	SNV/indel + CNV/SV、非编码、均一覆盖、相位	发现型、复杂 SV、非经典抗原优先；上调多少由目标 VAF 与验证 LoD 决定^1·26	独立覆盖、插入片段、mapping、SV caller 共识、纯度/倍体
肿瘤 RNA-seq	无统一值；预算网格 50–100M paired-end fragments，须定义计数单位	mutant expression、融合、剪接、HLA 表达、转录本相位	按基因/融合检测饱和度、DV200、有效比对与目标表达水平调整；读长由 assay 验证^2·3·12	RIN 或 DV200、rRNA、strandedness、junction saturation、位点有效覆盖、RNA VAF
专门 HLA NGS	不设统一 ×/locus；按实验室验证的最低位点有效读数/覆盖	相位清楚的 I/II 类等位基因与歧义解析	文献中的 100×仅是特定算法/数据集基准，不是临床放行阈值^4·5·6	最低 locus 覆盖、allele balance、dropout、ambiguity、一致性与数据库版本
多区域/转移灶	按临床问题选 2–3 个区域	克隆性、空间异质性、共有 truncal targets	低 TMB、高异质性或多病灶优先；不能用混样掩盖区域差异	分别建库、分别 purity/CNV，再做跨区组合

必需分析

CNV · purity · ploidy · CCF

由 WES/WGS 反推等位拷贝数与癌细胞比例；候选优先级应使用 CNV 校正后的 clonality，而不是裸 VAF。

低 TMB / 复杂事件

融合 · 剪接 · 长读长 RNA

短读长先用两个 caller 共识；重要 fusion/frameshift 以 RT-PCR/靶向测序验证 ORF。长读长用于相位和完整 isoform，不是默认替代。

免疫监测

TCR-seq · scRNA/TCR · ctDNA

用于接种前后克隆扩增、组织迁移与 MRD 动力学；它们不替代候选发现所需的肿瘤组织 RNA。

探索增强

Ribo-seq · immunopeptidomics

Ribo-seq 支持非经典 ORF 的实际翻译；HLA-IP LC–MS/MS 给出天然呈递强阳性，但未检出不能当作绝对阴性。

WES

什么时候它反而是更好的答案？

交付窗口紧、预算需要换取更深的低 VAF 灵敏度；
候选池以 coding SNV/indel 为主；
FFPE DNA 不适合高质量 WGS；
平台已有经过验证的 WES 变异和 neoantigen SOP。

代价是捕获偏差、HLA 区覆盖不均，以及对 SV、非编码和部分融合的能力有限。

WGS

什么时候值得付出额外成本？

要系统发现 fusion/SV、非编码或非经典 ORF；
需要更可靠的 CNV、纯度、倍体与相位；
低 TMB 肿瘤必须扩大候选来源；
希望建立长期可扩展的发现平台。

WGS 也必须配 RNA；DNA 上“可能编码”不等于实际转录和呈递。

HLA DESIGN

遗传分型、HLA-I 肿瘤逃逸与 HLA-II APC 呈递要分开

正常血给出患者的胚系 HLA。HLA-I 候选还要看肿瘤 LOH/ASE、B2M 与加工通路；HLA-II 候选则要分别记录宿主 APC 呈递能力和肿瘤 HLA-II 状态，后者低表达本身不是通用硬淘汰条件。^24·25

建议写入送检合同

正常血 DNA · 长扩增子或靶向捕获 · 高分辨率 NGS

Class IHLA-AHLA-BHLA-C

Class IIDRB1DRB3/4/5DQA1/DQB1DPA1/DPB1

分辨率：至少二字段；罕见、null/low-expression 或歧义组合继续解析到更高字段。⁴
覆盖：优先全基因或近全基因相位；只测 antigen-binding exons 容易留下 cis/trans 歧义。⁶
深度：不预设跨平台的 ×/locus。合同写最低位点有效读数/覆盖、allele balance、dropout、call ambiguity，以及该实验室验证的准确度、精密度与重复规则。文献 100×仅是特定算法基准。^4·5·6
复核：用 HLA-HD / HISAT-genotype 与 WES/WGS/RNA 交叉；discordant、罕见或纯合结果必须人工复核或正交确认。

02 · NEOANTIGEN RANKING

最稳健的逻辑不是一个总分，而是 Gate → Rank → Diversify

先清除变异或序列不可信的候选，把表达未检出和 HLA 状态不确定单独标注并复核，再在可行集合内排名，最后按 HLA、克隆、CD4/CD8 和变异类型做组合约束。

Tier 1

Missense / in-frame indel

DNA + RNA 确认，注释风险最低，是当前主线。

Tier 1–2

Frameshift / stop-loss

新生序列更“异物”，但必须重建 ORF、NMD 与相位。

Tier 2

Fusion / splice / retained intron

必须有 junction、正确阅读框与正交验证。

Tier 3

Non-canonical ORF / RNA editing / viral

需要更强的正常组织排除、Ribo-seq、蛋白组或直接呈递证据。

变异真实

肿瘤支持、正常阴性、过滤伪影、样本身份一致

序列正确

正确转录本、相位、frameshift/fusion ORF 与 mutant window

表达证据

mutant RNA 阳性优先；未检出时检查有效覆盖、纯度、转录本与正交结果

呈递可能

I/II 类 EL %Rank 与加工；HLA-I 逃逸、HLA-II APC 路径分别解释

免疫识别

mutant-vs-WT 差异、foreignness、TCR 模型仅作辅助

覆盖肿瘤

优先 clonal/truncal、驱动或多区域共有突变

组合可造

窗口长度、连接区、重复/毒性 motif、序列稳定与平台容量

硬门槛

必须通过

somatic call、蛋白改变、正常对照支持体细胞归属、HLA genotype 可信；表达和逃逸按证据充分度分层，未检出不自动等于阴性。

连续排序

证据越强越靠前

EL %Rank、表达、RNA VAF、癌细胞比例、pMHC 稳定性、mutant-vs-WT 差、外源相似性、MS/T-cell 证据。

组合约束

不要把鸡蛋放一篮

在患者实际等位基因允许时，分散覆盖多个 HLA-I 与 HLA-II 组合，兼顾 CD8/CD4、多个克隆和不同通路；不为凑数牺牲证据质量。

ALGORITHM MAP

算法该如何组合

任务	主路径	交叉工具	决定性注意点
变异与克隆性	Mutect2 + Strelka2；indel 可加 Lancet	FACETS / Sequenza + PyClone-VI	必须保留 caller、版本、过滤原因与原始支持 reads
HLA 分型	HLA-HD / HISAT-genotype	OptiType（I 类）+ arcasHLA（RNA）	临床构建用正常血专门分型作锚点，推断工具用于交叉核对
HLA-I 呈递	NetMHCpan 4.2e（EL %Rank）	MHCflurry 2.0 / MixMHCpred / HLAthena	0.5% / 2% 只是工作点；锁定 context 模式、allele 库、肽长与补丁版本⁷
HLA-II 呈递	NetMHCIIpan 4.3k	MixMHC2pred	同时跑 DR、DQ、DP；默认 1% / 5% 也不是免疫原性证明⁸
端到端	pVACtools 7.1.2	Vaxrank / MuPeXI / ImmunoNX	固定数据库、转录本、HLA 库和模型版本后才能复现⁹
TCR 识别	PRIME / BigMHC / DeepImmuno（辅助）	外源相似性、WT 对照与结构特征	只作次级排序；不能替代自体 T 细胞实验

不要这样做：把 NetMHC、TPM、VAF、foreignness 的原始数值直接加权求和，然后把 top 20 当“真相”。不同 HLA、模型与样本间分数并不同尺度。更好的做法是记录每一层证据、先通过门槛、再按患者内 percentile 排序，并让人工委员会看完整证据卡。

03 · CONSTRUCT

接多少个？接多长？先用 amino acids 决策

“几个 base pair 接起来”不是起点。先定义 mutant protein context，再反向翻译。25–31 aa可作为 SNV 开发网格，用于同时评估 HLA-I 8–11mer 与 HLA-II 15mer；最终窗口须由具体平台实验收敛。

12–20

候选组合开发网格

不是通用疗效标准。若只有 6 个可信候选就做 6 个；不要用弱候选凑数。

27 aa

一个公开 SNV 先例

autogene cevumeran 将突变置中、两侧各 13 aa；fusion/frameshift 应按真实新 ORF 调整。¹²

≈1,080 nt

该先例每条 RNA 的抗原/连接区

10×27 aa 为 810 nt；9×10 aa G/S-rich linker 为 270 nt，合计约 1,080 nt，未计 targeting domain。¹²

2 条 RNA

最多 20 个的公开实现

该平台每条不超过 10 个；其他平台的窗口、linker、RNA 条数和 ORF 长度必须单独验证，不设统一上限。¹²

推荐构型

多表位串联 minigene

Signal / targeting→NeoAg 01GS×10 aaNeoAg 02AAY?NeoAg 03…NeoAg 10

直接串联：最简单，但每个 junction 都要扫描。
10 aa G/S-rich：autogene cevumeran 的公开临床先例；不保证没有 junctional binder。¹²
AAY / GPGPG：可作为 I 类或 II 类处理的候选 spacer；不是自动安全答案，必须对患者全套 HLA 重算。
拆成两条 RNA：已有最多 20 个候选、每条最多 10 个的临床先例；其他平台仍需按 ORF、递送与工艺验证。¹²

组合目标

克隆覆盖

truncal 优先，必要时保留少量亚克隆候选应对异质性

HLA 覆盖

A/B/C 与 DR/DQ/DP 不集中于单一 allele

T 细胞覆盖

不要只做 CD8；临床研究中 CD4 应答经常占重要部分

逃逸韧性

HLA-I 肿瘤逃逸与 HLA-II APC 呈递分开判断，再跨通路分散

04 · CODON OPTIMIZATION

密码子优化不是“把 CAI 拉满”

正确做法是生成一组同义候选，在硬约束下寻找多目标 Pareto 前沿，再用相同 cap、UTR、poly(A) 与递送做小规模表达/呈递筛选。

HARD

不可违反

蛋白序列完全一致；无意外 AUG/stop、frame、长同聚体、禁用限制位点、强 cryptic splice/poly(A)、高重复与供应商禁区。

LOCAL

起始区要开放

预先定义并报告 AUG 周围的比较窗口（例如 50–100 nt），避免过强局部 hairpin；窗口本身不是统一生物学阈值。

GLOBAL

全长要稳定但可翻译

同时看 CAI、codon-pair、整体/窗口 GC、MFE、ensemble diversity、重复与 RNase-sensitive motif。

VERIFY

用实验选赢家

mRNA 半衰期、翻译曲线、正确产物、天然呈递、先天炎症与 T 细胞激活共同决定。

TOOL SCORECARD

先做功能矩阵，再做平台内评分

“支持”表示公开版本中有直接功能；“部分”表示需外接规则；“非核心/未验证”表示不能据此替代实验。数值总分只有在同一 rubric、同一版本和同一验证集内才可比较。

工具	核心能力	透明度	约束能力	结构建模	推荐用法
LinearDesign	CAI × 全局 MFE 的 Pareto 设计	支持：论文与参数可查	部分：需二次筛查	支持：全局结构目标	输出候选与参数；再叠加制造硬约束¹⁵
mRNAid	GC、motif、稀有密码子、U depletion、MFE	支持：多目标可解释	支持：规则较完整	支持：含 MFE 目标	适合生成多目标候选集¹⁶
DNA Chisel	自定义 hard constraints + objectives	支持：规则与日志可查	支持：强项	非核心：需外接模型	适合作为可审计约束引擎¹⁷
商业合成平台	合成、motif 与工艺可制造性	未验证：通常黑箱	部分：供应商内部	未验证：需索取方法	只在同一供应商、同一版本内比较

CAI用于同一宿主/同一 ORF 候选间比较；不设“越接近 1 越好”的单一门槛。

GC%45–65%可作为候选生成网格，避免极端滑窗；必须在本平台由表达、稳定性、可制造性实验收敛，不是法规限值。

5′ MFE起始区相对开放；报告窗口、温度和算法版本，否则数值不可比。

Global MFE较稳定可能延长半衰期，但不能牺牲正确翻译；LinearDesign 数据并非肿瘤疫苗临床放行标准。

Motifs同聚体、重复、CpG/UpA、cryptic splice/poly(A)、RNase motif 依平台定义并版本化。

Fidelity特定 slippery sequence 曾报告 N1mΨ 相关移码；开发阶段可筛查高风险序列并用蛋白/质谱确认，证据仍在演进且没有通用数值阈值。²²

05 · mRNA ARCHITECTURE

常用修饰：一条成熟骨架 + 一个关键分叉

最重要的分叉不是“要不要修饰”这么简单，而是N1mΨ 高表达/低非特异炎症与未修饰 uridine 的可控自佐剂作用。治疗性肿瘤疫苗中，两者都有临床平台，必须与递送共同评估。

Cap 15′ UTRKozak · 多新抗原 ORF3′ UTRpoly(A)

Cap 1

提高稳定与翻译，降低 IFIT 识别。共转录或酶法均可，关键是 cap 率、方向、Cap0/1 分布和未加帽 RNA。²¹

验证过的 UTR + Kozak

在目标 APC/肌细胞中筛选表达曲线；检查 uAUG、局部结构、miRNA/RBP 位点。不要直接复制商业疫苗序列。

Poly(A) 分布

模板编码通常更均一；酶法需额外控制长度分布。100–120 nt 可作为工程网格，必须按本平台表达与稳定性实验收敛，不是通用放行值。

残留 dsRNA 控制

用 HPLC、cellulose 或经验证替代工艺降低 dsRNA，并以适用方法定量残留；依据工艺能力、效力和先天免疫风险建立可验证接受限与趋势控制。^20·29

完整性与杂质

全长比例、截短/延长体、残留 DNA/NTP/酶、聚集体、内毒素与生物负载进入 CMC 控制矩阵。FDA 的 2023 文件是预防性 LNP-mRNA 公开研讨会材料而非正式指南，2026 效力文件仍为非约束草案。^18·29

抗原定向域

Signal、endosomal/lysosomal targeting 或 MITD 可提高 I/II 类呈递，但增加 ORF 和加工复杂度；需要 ligandome/T-cell 数据。

分支 A

N1mΨ 全替代 U

候选场景：已有平台先例的 IM-LNP、强调高表达和可控 reactogenicity

在细胞和动物模型中可提高表达并降低部分先天免疫激活；³⁰
仍需用经验证工艺降低并定量残留 dsRNA；
对高风险序列做蛋白/质谱确认，不设通用移码放行阈值。²²

分支 B

未修饰 uridine

适合：已验证的 RNA–LPX / APC 定向平台，把先天刺激纳入机制

可提供自佐剂作用，但窗口更窄；
系统性 IFN 过高会抑制翻译并增加反应；
autogene cevumeran 是公开的人体临床先例。^12·13

建议的 A/B 试验：同 ORF、同 UTR、同 Cap1、同 poly(A)、同纯化、同递送，仅比较 U 与 N1mΨ；同时测表达曲线、HLA ligandome、IFN/IL-6/CXCL10、细胞活率和抗原特异 T-cell activation。只看 luciferase 峰值会选错。

06 · DELIVERY

IM ionizable LNP 是成熟候选之一；机制验证可用 DC 电转

递送决定 mRNA 到达谁、在哪里翻译、引发多强的先天免疫。平台、给药途径和核苷化学必须成套验证；V940 的 IM 证据不能直接外推到 ID，后者应作为独立开发路线。

成熟候选之一

IM · Ionizable LNP

V940 是 IM 个体化 mRNA-LNP、每条可编码最多 34 个新抗原；随机 IIb 已发表，2026-08-19 官方公告三期达到 RFS 与 DMFS 顶线终点。产品仍属 investigational，完整数据、同行评议与监管审评尚待完成。^14·31

最适合: 已有 LNP/IM 平台能力的产品化路线
重点测: 粒径/PDI、包封率、内体逃逸、局部与系统炎症

成熟分支

IV · RNA–LPX

通过电荷/粒径把 RNA 导向脾与淋巴器官 APC；可把未修饰 uridine 的先天刺激纳入机制。需要成熟输注与细胞因子风险控制。^13·28

最适合: 已有 RNA–LPX 平台和静脉给药经验
重点测: APC biodistribution、IFN window、补体与输注反应

机制桥接

Ex vivo · DC mRNA 电转

可直接验证整条构建在患者 APC 中的表达、加工、呈递和 T 细胞激活；但白细胞单采、个体化生产和批间差异使其更复杂。

最适合: 候选/构建验证或已有细胞治疗设施
重点测: DC 身份/成熟/活率、转染、迁移、potency

探索性

裸 mRNA / protamine / polymers / exosomes

可用于特定早研问题，但转染、稳定性、批间差异或工艺成熟度通常不如前述平台。不要把“配方简单”误当作“临床路径简单”。

最适合: 明确假设驱动的探索研究
重点测: 实际 APC 摄取、降解、剂量与组织分布

07 · VALIDATION

把每个计算假设配上一项能证伪它的实验

最有价值的证据链是：突变真实 → 突变表达 → 天然呈递 → 突变特异 T-cell → 自体肿瘤杀伤。预测结合、外源肽刺激和真正肿瘤识别是三个不同层级。

要证明的逻辑	推荐实验	Go 的含义	Fail 后怎么做
突变是真的	同一样本的独立建库或靶向深测；必要时 ddPCR	肿瘤支持、正常阴性、链偏/FFPE 伪影可解释	不进入候选池
突变被表达	RNA-seq + IGV 人工复核；靶向 RNA / ddPCR	突变等位 reads 阳性为优先证据；转录本与相位正确	未检出先查位点覆盖、纯度和可比对性；充分灵敏度下仍无支持才降级或淘汰
HLA 能呈递	重组 pMHC 结合/稳定性；转染 APC 后 HLA-IP LC–MS/MS	至少一条正交证据支持；MS 阳性是强证据²⁷	改窗口/顺序；持续阴性则淘汰
T 细胞会识别	ELISpot + AIM/ICS；multimer；TCR-seq	mutant > WT，CD4/CD8 表型明确，可重复	回到候选排序；排查 naïve 频率与 assay 灵敏度
能杀肿瘤	自体肿瘤、类器官或 HLA 匹配靶细胞杀伤；HLA 阻断	杀伤依赖突变与 HLA，而非只杀 peptide-pulsed 细胞	若只认高浓度肽，原则上 No-Go
构建能工作	整条 mRNA 转染 APC；蛋白/targeted MS + T 细胞激活	连接后仍正确加工呈递，无异常 reading frame	重排、换 linker 或拆成两条 RNA
产品可放行	identity、完整性、cap、poly(A)、dsRNA、残留 DNA、无菌/内毒素	使用平台验证的规格与趋势控制^18·29	批次 No-Go；不能用免疫活性抵消质量失败
递送可重复	粒径/PDI、包封率、游离 RNA、细胞摄取/内体逃逸、potency	物化 + 细胞功能矩阵同时合格	回到配方或工艺，不直接推进患者批

Tier 1

分析验证

样本身份、病理纯度、DNA/RNA/HLA、变异相位、重复建库、版本锁定。没有这一层，后面所有“免疫原性”都可能针对错误序列。

Tier 2

呈递验证

pMHC binding/stability、HLA stabilization、转染 APC 的 HLA-IP LC–MS/MS。MS 未检出不是绝对阴性，但阳性是强证据。

Tier 3

功能验证

mutant vs WT、无关肽、mock mRNA、空 LNP、HLA blocking 全部入组；ELISpot 至少配一项 AIM/ICS/multimer/杀伤正交方法。

Tier 4

产品与转化

效力 assay matrix、稳定性、重复给药、biodistribution、HLA 转基因/人源化模型、临床 PBMC/TCR/ctDNA 与肿瘤活检。

最容易被漏掉的 6 个控制

Mutant vs WT：证明突变特异，而非原蛋白自反应。

Peptide-pulsed vs minigene/mRNA：区分外源加载与天然加工。

HLA blocking / knockout：确认限制性 allele。

Empty LNP / mock RNA：剥离载体和先天刺激。

自体肿瘤 / 类器官：确认真实靶细胞能被识别。

预设阳性/阴性阈值：盲法、重复与 assay acceptance 先于结果。

RECOMMENDED STACK

我会如何做第一版研究方案

1
样本
病理复核 + 肿瘤纯度/坏死 + 身份追踪。实体瘤正常对照通常用外周血；血液肿瘤需经验证的非造血正常来源，不能机械照搬。
2
测序
先按 purity、目标 VAF、捕获均一性和 assay LoD 反推；预算可用页面情景网格。WGS 以 ICGC 60×/30×研究级起点为锚；WES/RNA 不设跨平台统一深度或读长。
3
HLA
正常血专门高分辨率 NGS，覆盖 A/B/C、DRB1/3/4/5、DQ 与 DP；HLA-I 肿瘤 LOH/ASE、B2M/加工通路与 HLA-II APC 呈递路径分开解释。
4
筛选
以 pVACtools 7.1.2 为可审计主干，NetMHCpan 4.2e + NetMHCIIpan 4.3k，并用第二套 presentation 模型交叉；锁定模式、数据库、参数和容器摘要。
5
构建
把 12–20 个、25–31 aa 当开发网格。公开 27 aa 先例为最多 20 个、两条 RNA、每条 ≤10 个、10 aa G/S linker；最终设计做全 HLA junction scan。
6
序列与化学
Cap1、筛选过的 UTR、受控 poly(A)、经验证工艺降低并定量残留 dsRNA；N1mΨ-LNP 与 U-RNA–LPX 作为两套平台逻辑，不混用结论。
7
验证
平台开发或样本允许时，对扩展候选集做 pMHC/自体 T-cell 筛查；患者批生产采用与周转时间匹配的分层证据。整构建仍须重新验证加工呈递与功能。
8
放行与临床转化
平台化 CMC + patient-batch identity/integrity；伦理、知情同意、遗传数据保护、GMP 和监管沟通从项目第一天并行。

NO-GO 条件

样本身份或 HLA 经复核仍不确定；在充分位点覆盖/灵敏度与正交复核后仍无表达支持；CD8 候选只依赖已确认丢失/失活的 HLA-I；整构建不能天然呈递；T 细胞只识别高浓度外源肽而不识别适当肿瘤靶；mRNA/LNP 质量或效力矩阵不合格。

EVIDENCE LEDGER

来源与证据边界

参数来自指南、工具官方文档和人体/方法学原始研究。不同平台之间不能直接复制放行阈值；本文将“临床先例”“工程起点”和“通用原则”分开表述。

ICGC ARGO：癌症 WGS、肿瘤/正常配对与深度原则2023 · 打开原始来源 ↗

Nature Cancer：GBM 个体化 DNA 疫苗试验的单项目 WES/RNA/HLA 参数2026 · 打开原始来源 ↗

Neoantigen bioinformatics best practices2019 · 打开原始来源 ↗

ASHI Standards：高分辨率 HLA 至少二字段2024 · 打开原始来源 ↗

HLA 工具与深度基准：100×以上提高三字段准确率2021 · 打开原始来源 ↗

全基因/近全基因 HLA 扩增测序性能研究2020 · 打开原始来源 ↗

DTU NetMHCpan 4.2e（HLA-I）2026-07 update · 打开原始来源 ↗

DTU NetMHCIIpan 4.3k（HLA-II）2026 update · 打开原始来源 ↗

pVACtools 7.1.2 文档2026 · 打开原始来源 ↗

pVACvector 7.1.2：连接区新表位与 spacer 计算筛查2026 · 打开原始来源 ↗

TESLA consortium：预测候选中约 6% 经实验确认免疫原性2020 · 打开原始来源 ↗

Autogene cevumeran：最多 20 个新抗原、两条 RNA、G/S-rich linker2024 · 打开原始来源 ↗

PDAC 个体化 uridine mRNA–LPX 一期研究2023 · 打开原始来源 ↗

KEYNOTE-942：V940 + pembrolizumab 随机 IIb2024 · 打开原始来源 ↗

LinearDesign：联合优化密码子与全局二级结构2023 · 打开原始来源 ↗

mRNAid：多目标、可约束的 mRNA 序列设计2024 · 打开原始来源 ↗

DNA Chisel：可审计的约束式序列优化2020 · 打开原始来源 ↗

FDA 公开研讨会材料：预防性 LNP-mRNA 质量与表征问题（非正式指南）2023 · 打开原始来源 ↗

Ψ 等核苷修饰降低先天识别的机制研究2005 · 打开原始来源 ↗

Cellulose 去除 dsRNA 杂质的原始研究2019 · 打开原始来源 ↗

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